Diluciones seriadas para la obtención de un cultivo axénico Microbiología

DILUCIONES SERIADAS PARA LA OBTENCIÓN DE UN CULTIVO AXÉNICO.

Introducción.

Una dilución en serie es la reducción progresiva, paso a paso, de la concentración de una sustancia en disolución. Por lo general, el factor de dilución en cada paso es constante, lo que da como resultado una progresión geométrica de la concentración, en forma logarítmica. Las diluciones en serie se utilizan para crear disoluciones muy diluidas con precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se pretenda estudiar curvas de concentración con una escala logarítmica. Las diluciones en serie son ampliamente utilizadas en las ciencias experimentales, incluyendo bioquímica, química, farmacología, microbiología y física, así como en la homeopatía.

El factor de dilución es el número total de volúmenes al que se lleva un volumen dado de muestra original, o parte alícuota. En otros términos, el factor de dilución también corresponde a la división de la concentración de la muestra original sobre la concentración de la muestra diluida.

En biología y medicina, además de los usos más convencionales, descritos anteriormente, la dilución en serie también se puede utilizar para reducir la concentración de microorganismos o células de una muestra. Como, por ejemplo, el número de colonias de bacterias que crecen en una placa de Petri en un momento dado depende de la concentración, y dado que muchas otras técnicas de diagnóstico implican contar físicamente el número de microorganismos o células en ciertas áreas impresas dentro de una rejilla (comparando las concentraciones de dos tipos de células o microorganismos en la muestra) o en cavidades de un volumen determinado (para concentraciones absolutas), la dilución puede ser útil para obtener resultados más manejables o para tener un número definido de colonias de cultivo en cada placa. La dilución en serie es también un método más barato y más sencillo para preparar los cultivos de una sola célula que el empleo de pinzas ópticas y micromanipuladores.

Objetivos.

-Realizar diluciones seriadas de dos muestras para obtener un cultivo axénico.

-Aplicar la técnica de estriado en placa usando perlas de vidrio.

-Realizar adecuadamente la técnica de vertido en placa para el aislamiento microbiano.

Metodología.

Extensión en placa.

Se preparan con las mediciones que se muestran a continuación medios de cultivo YPD y Caldo Nutritivo Sólido:

CALDO NUTRITIVO:

	Para 1000 ml
Peptona	5.003 g
Extracto de Carne	3.006 g
Agar Bacteriológico	14.998 g
Cloruro de Sodio	3.002 g

YPD

	Para 1000 ml
Dextrosa	20 g
Peptona	20 g
Agar Bacteriológico	20 g
Extracto de levadura	10 g

Esterilizamos en el autoclave nuestros medios de cultivo, tubos eppendorf, puntas amarillas, perlas y 150 ml agua destilada (aproximadamente) durante una hora aproximadamente, después continuamos con la preparación de las diluciones seriadas.

Todo el proceso que viene a continuación tiene que realizarse dentro de la campana de flujo laminar. Tomamos 1 g de nuestra muestra (Piña en descomposición y la diluimos en 5 ml de agua destilada y esterilizada (previamente en el autoclave).

En la dilución seriada,  una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes.

Las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso.

Transcurridas 24 horas de realizar la siembra de microorganismos por dilución seriada en placa, realizamos tinción Gram de la siguiente forma:

-Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero.

-Colocar una gota de agua destilada y luego esterilizar el asa bacteriológica.

-Tomar una pequeña muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos.

-Posteriormente esterilizar el asa.

-Fijar la muestra al calor flameandola en el mechero, cuidando no quemar la muestra.

-Colocar el portaobjetos sobre un soporte.

-Cubrir la muestra con cristal violeta, esperar 1 minuto y enjuagar.

-Cubrir la muestra con solución de Lugol, esperar  1 minuto y enjuagar.

-Cubrir la muestra con alcohol-acetona, esperar que transcurran 5 segundos y enjuagar.

-Cubrir la muestra con safranina, esperar 1 minuto y enjuagar.

-Dejar secar la muestra.

-Observar en el microscopio con todos los aumentos.

-Agregar  1 gota de aceite de inmersión y observar en el microscopio a 100x.

Por último, esterilizamos nuestros residuos (Cajas Petri ó medios de cultivo) durante 1 hora en el autoclave y rotulamos.

Los residuos se empaquetan y guardan en el laboratorio (refrigerador), una vez ya Esterilizados pueden ser desechados en la parte trasera del Laboratorio de Bioquímica.

Materiales.

-20 Cajas Petri.

-Tubos eppendorf.

-Puntas amarillas y Azules para micropipetas.

-Micropipetas de 1000 y 200 ul.

-3 Frascos de vidrio.

-Matraz Erlenmeyer.

-3 Vasos de precipitados de 100 ml.

-2 Agitadores.

-Balanza.

-Parrilla.

-Mechero Bunsen.

-2 Asas bacteriológicas.

-1 Parrilla de tinción.

-5 Pipetas Pasteur con Bulbo.

-1 Recipiente de plástico de 500 ml.

Equipo:

-Autoclave.

-Campana de flujo laminar.

-Microscopio.

Reactivos:

-Peptona de caseína.

-Cloruro de Sodio.

-Extracto de Carne.

-Agar Bacteriológico.

-Extracto de Levadura.

-Dextrosa.

-Cristal Violeta.

-Lugol.

-Alcohol acetona.

-Safranina.

-Aceite de inmersión.

Resultados.

Para los medios de cultivo con la siembra a través de diluciones en serie con extensión en placa transcurridas 48 horas:

YPD A LAS 16 HORAS (Muestra Piña en Descomposición)

	COLONIAS	ELEVACIÓN	FORMA
10^1	1	CONVEXA	CIRCULAR
10^2	20	CONVEXA	CIRCULAR
10^3	INCONTABLES	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^4	1	PLANA	RIZOIDE
10^5	INCONTABLES	MARTICULAR	RIZOIDE
10^6	NINGUNA	PLANA	CIRCULAR
10^7	10	PLANA	LAMENTO

YPD A LAS 24 HORAS

	COLONIAS	ELEVACIÓN	FORMA
10^1	3	CONVEXA	CIRCULAR
10^2	INCONTABLES	CONVEXA	CIRCULAR
10^3	INCONTABLES	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^4	4	PLANA	RIZOIDE
10^5	INCONTABLES	MARTICULAR	RIZOIDE
10^6	5	PLANA	CIRCULAR
10^7	INCONTABLES	PLANA	LAMENTO

CALDO NUTRITIVO SOLIDO A LAS 16 HORAS (Muestra Piña en Descomposición)

	COLONIAS	ELEVACIÓN	FORMA
10^1	3	CONVEXA	CIRCULAR
10^2	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^3	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^4	25	CONVEXA	CIRCULAR
10^5	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^6	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^7	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA

CALDO NUTRITIVO SOLIDO A LAS 24 HORAS

	COLONIAS	ELEVACIÓN	FORMA
10^1	8	CONVEXA	CIRCULAR
10^2	5	CONVEXA	NO PRESENTA
10^3	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^4	INCONTABLES	CONVEXA	CIRCULAR
10^5	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^6	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA
10^7	NINGUNA	NO PRESENTA	NO PRESENTA

Tinción Gram.

Transcurrieron aproximadamente 10 días después de que se realizó la siembra quedando guardado 7 días en el Refrigerador del Laboratorio de Bioquímica para interrumpir el crecimiento de las colonias en los medios de cultivo. Después de realizó Tinción Gram a nuestras muestras.

Discusiones.

-Las diluciones seriadas en extensión de placa que presentan saturación en colonias (incontables) y presentan cultivos mixtos son las siguientes:

10^1, 10^2, 10^3.

Por lo cual se deduce que estas muestras no son factibles para poder obtener un cultivo axénico (puro) ya que la muestra que se suministró en el medio está demasiado Saturada y por lo tanto no se puede realizar lo mencionado.

-Las diluciones seriadas en extensión de placa que presentan un número de colonias contable y no saturado, así como distribuido y manejable son las siguientes:

10^4, 10^5.

Por lo cual son factibles para obtener un cultivo axénico (puro) ya que estas diluciones no se encuentran saturadas y a la vez no se encuentran  muy diluidas y pueden presentar colonias dentro de nuestro medio de cultivo.

-Las diluciones en extensión de placa que no presentan un  número suficiente de colonias para obtener un cultivo axénico (puro) son las siguientes:

10^6 y 10^7.

Estas diluciones no son factibles para obtener un cultivo axénico al igual que las que presentan saturación, por lo tanto procedemos a esterilizar con estas muestras.

-Al realizar la tinción Gram se llega a la conclusión de que los colorantes (Cristal violeta, lugol, safranina) no se encuentran 100% factibles para realizar una tinción adecuada y poder determinar si los microorganismos son Gram positivo o negativo.

Así mismo el decolorante Alcohol cetona actúa de manera eficaz contra la coloración de los mencionados anteriormente ocasionando que los microorganismos no puedan teñirse y observarlos con eficacia en el microscopio.

-El vertido en placa no se realizó ya que no poseíamos los conocimientos de la práctica correcta de esta técnica.

Conclusiones.

-Podemos obtener un cultivo axénico (puro) con los resultados de las diluciones 10^4 y 10^5 de nuestras muestras de YPD y de Caldo Nutritivo (Piña y Leche en descomposición respectivamente).

-Las diluciones restantes fueron esterilizadas y desechas después de haber aplicada Tinción Gram en ellas y analizado en el microscopio.

-Se realizaron correctamente las diluciones en extensión de placa.

-Se realizó correctamente la siembra de las diluciones por medio de perlas esterilizadas.

-Los objetivos fueron cumplidos correctamente.

Bibliografía.

Brock. (2001). Biología de los Microorganismos. USA: 10

Brock. (1997). Microbiología. USA: 4.

Anexos.

Dextrosa: La glucosa es un monosacárido con fórmula molecular C6H12O6. Es una hexosa, es decir, contiene 6 átomos de carbono, y es una aldosa, esto es, el grupo carbonilo está en el extremo de la molécula.

Fórmula: C6H12O6

Masa molar: 180,1559 g/mol

Denominación de la IUPAC: D-glucose

Punto de fusión: 146 °C

Densidad: 1,54 g/cm³

Soluble en: Agua, Ácido acético

Extracto de Carne: El extracto de carne es un caldo de carne muy concentrado, normalmente de vacuno. Se usa para dar sabor a carne a diversas recetas, y para elaborar consomés y sopas.

El extracto de carne fue inventado por barón Justus von Liebig, el químico orgánico alemán del siglo XIX. Liebig se especializó en la clasificación de la comida y escribió un ensayo sobre cómo cocer la carne sin destruir su valor nutricional. Movido por ell deseo de ayudar a los desnutridos, en 1840 desarrolló un extracto de vaca concentrado, extractum carnis Liebig, para proveer de un sustituto barato y nutritivo de la carne a quienes no podían adquirirla. Por desgracia, se necesitaban 30 kg de carne para producir 1 kg de extracto, lo que lo hacía demasiado caro.

Peptona de Caseína: Peptona de caseína es un digerido enzimático de caseína. Se utiliza en la formulación de medios de cultivo de una amplia variedad de microorganismos.

ASPECTO: Polvo amarillento.

Ensayo

Análisis

Nitrógeno Amínico (AN)              3.1 %

Nitrógeno Total (TN)     12.6 %

AN / TN               24.6 %

Solubilidad en agua        Soluble

Pérdidas por secado      4.9 %

Cenizas                6.2 %

pH (solución 2%)             5.7

Extracto de Levadura: es un extracto soluble en agua formado por el autolisado de células de levaduras. Es un producto rico en vitaminas especialmente del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento. Es utilizado en microbiología en la preparación de una amplia variedad de medios de cultivo como excelente fuente de nutrientes. También se obtiene como producto residual de la elaboración de la cerveza, empleándose en la industria de la alimentación frecuentemente como aditivo.

Agar Bacteriológico: Es un agua soluble de extracto coloidal obtenido a partir de ciertas especies de marinos, algas rojas, incluyendo Gelidium, Pterocladia, y Gracilaria. Las impurezas, residuos, minerales y pigmentos se reducen a niveles específicos durante su fabricación.