Microbiologia Preparación de Medios de Cultivo YPD, Agar-Agar y Caldo Nutritivo

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Introducción:

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

Objetivos:

-Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir de medios de cultivo deshidratados.

-Aprender a preparar correctamente los medios de cultivo que se utilizan en microbiología.

-Preparar 3 diferentes medios de cultivo, y agregar los componentes de cada uno en el orden apropiado y clarificarlos correctamente.

-Esterilizar los medios de cultivo y vaciarlos correctamente en las cajas Petri.

Metodología

1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, añadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentración deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullición del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolución del agar (medios sólidos y semisólidos); para medios líquidos no es necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta la completa disolución de la misma.

2. Esterilizar la disolución.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento será diferente:

a) Medios sólidos en placa.- Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar al autoclave (1210C) durante 15-20 minutos. Una vez estéril repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo para que solidifique.

b) Medios líquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razón de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapón de aluminio y llevar a esterilizar en autoclave.

Materiales

-3 Matraces Erlenmeyer de 500 ml

-Espátula

-Parrilla Eléctrica con Agitador Magnético

-Agua destilada

-Tapones de pañalina

-Probeta 100 ml

-Asa bacteriológica

-Mechero Bunsen

-20 Cajas Petri

-5 Vasos de precipitados de 50 ml

-5 Pipetas Pasteur

-12 Tubos de ensayo con taparrosca 10/150

-Autoclave

-Incubadora

Reactivos

-Extracto de carne

-Peptona

-Peptona de caseína

-Extracto de levadura

-Cloruro de sodio

-Dextrosa

-Infusión de Sangre

-Agar bacteriológico

-Triptona de Caseína

Desarrollo Experimental

Investigamos la metodología correcta para la preparación de medios de cultivo para Caldo Nutritivo, Agar-Sangre, Agar-Agar y YPD. Pesamos en las siguientes proporciones:

CALDO NUTRITIVO (70ML)

	1000 ml	70 ml
Peptona Caseína	5 g	0.35 g
Extracto de Carne	3 g	0.21 g
Cloruro de Sodio	8 g	0.56 g

AGAR-SANGRE (170ML)

	1000 ml	170 ml
Agar Base Sangre	40 g	1.7 g
Sangre	14.7 ml	2.5 ml

YPD (170ML)

	1000 ml	170 ml
Dextrosa	20 g	3.4 g
Peptona	20 g	3.4 g
Agar Bacteriológico	20 g	3.4 g
Extracto de Levadura	10 g	1.7 g

Después de pesar correctamente los reactivos, preparamos las soluciones en los matraces Erlenmeyer de 500 ml, introduciendo en orden (tabla) los reactivos, Dando lugar a que el matraz esté sobre la parrilla eléctrica y con el agitador magnético dentro. Los matraces tienen que estar rotulados y ordenados dependiendo el medio que contengan.

Agitamos los matraces hasta que el medio quede disuelto completamente, sin dejar “bromos” al fondo del matraz o en las paredes.

Para el caldo nutritivo, rotulamos los tubos en base a la muestra, añadimos las proporciones adecuadas a los tubos y los sellamos correctamente.

Tapamos los matraces, cuidando que el tapón hecho de algodón no tengo fugas.

Esterilizamos en el autoclave por 1 hora, adhiriendo Cinta Testigo a los matraces.

Debido a la falta de tiempo y saturación en la balanza analítica, dejamos reposando los matraces 24 horas en la Campana.

Rotulamos las cajas Petri de la siguiente manera: Tipo de medio de cultivo, Fecha y Número de Equipo.

Transcurridas las 24 horas, calentamos los medios solidificados y distribuimos en las cajas Petri cuidadosamente, la campana tiene que estar previamente limpia y con el Mechero Bunsen encendido, añadimos YPD a 10 cajas Petri y Agar-Agar a 9 cajas Petri.

Dejamos reposando aproximadamente de 10 a 15 minutos para que el medio solidifique, transcurrido este tiempo, sellamos las cajas Petri con cinta Parafilm.

Ordenamos las cajas Petri (rotuladas y con los medios de cultivo solidificados) junto con los tubos (con el caldo nutritivo dentro) y los introducimos en la Incubadora a temperatura y presión adecuadas.

CALDO NUTRITIVO:

Presenta color amarrillo, de tipo líquido, no presenta microorganismos (se encuentra bien esterilizado). Puede usarse para analizar muestras de alimentos, y todo lo mencionado en la metodología. El resultado es correcto.

YPD

Presenta color café oscuro, de tipo sólido, no existe presencia de microorganismos (se encuentra bien esterilizado). Puede ser utilizado para análisis mencionados en la metodología. Resultado correcto.

AGAR-SANGRE

No se realizó este medio de cultivo debido a que el reactivo “Agar Base Sangre” no se calculó correctamente y el medio quedó Semisólido.

Discusiones.

CALDO NUTRITIVO:

El caldo nutritivo se preparó correctamente, puede ser utilizado para análisis mencionados en la metodología, no presenta microorganismos (esterilizado correctamente), guardado y sellado en la Incubadora. Listo para realizar siembra. El resultado es el esperado y correcto.

YPD:

El YPD se preparó correctamente, puede ser utilizado para análisis mencionados en la metodología, no presenta microorganismos (esterilizado correctamente), sellado y guardado correctamente en la incubadora. Listo para realizar siembra. El resultado es el esperado y correcto.

AGAR-AGAR:

Este medio de cultivo debe ser sólido, no se realizó una correcta investigación de los componentes que debe tener (específicamente la cantidad de agar que debe ser suministrado para 1000 ml, en nuestro caso 170ml), el medio obtenido es de tipo Semisólido, correctamente sellado y guardado en la incubadora. Listo para realizar siembra. El resultado en el tipo de cultivo no es el esperado.

AGAR-SANGRE:

El reactivo “Agar Base Sangre” no se realizó correctamente ya que el medio quedó semisólido (No se colocó suficiente cantidad de Agar Base Sangre).

Conclusiones.

2 de los 3 medios de cultivo preparados pueden ser utilizados para realizar siembra, se encuentran correctamente sellados y guardados en la Incubadora.

-Adquirimos capacidad de preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes.

-Adquirimos la habilidad de preparar medios de cultivo para la materia de Microbiología.

-Se preparó correctamente dos medios de cultivo, el tercero (AGAR-AGAR) no presenta el tipo Sólido, pero puede seguir siendo utilizado para siembra de microorganismos.

-Los medios de cultivo fueron esterilizados correctamente (No existe presencia de microorganismos), ordenados correctamente en la incubadora y clarificados correctamente.

-Los objetivos fueron cumplidos.